RETTA DI TARATURA

Determinazione della concentrazione di specie in soluzione per via spettrofotometrica

1. Obiettivi

La spettrofotometria nel campo del visibile (350-750 nm) e dell’ultravioletto vicino (190-350 nm) (range comunemente esplorato da uno spettrofotometro convenzionale UV-visibile) ha una vastissima serie di applicazioni sia per quel che riguarda la determinazione e l’identificazione della struttura di molecole sia per quel che riguarda problemi analitici (determinazioni quantitative). La spettrofotometria UV-Visibile, infatti, rappresenta  un metodo molto potente per l’analisi  quantitativa  di soluzioni diluite (10^-3 - 10^-5 M). Il metodo analitico si basa sulla Legge di Lambert-Beer, che esprime la relazione lineare tra concentrazione ed assorbimento misurato ad una definita lunghezza d’onda.

2. Concetti di Spettroscopia

Spettroscopia elettronica. Range di applicazione. Intensità della radiazione, trasmittanza ed assorbanza. Legge di Lambert-Beer.

3. Esperimento

3.1 Strumentazione

Gli spettrofotometri convenzionali che operano in UV-Visibile possono essere a singolo o a doppio raggio. I primi sono quelli meno costosi. Quelli a doppio raggio sono più complessi, specialmente dal punto di vista ottico e meccanico. In particolare nello spettrofotometro a doppio raggio è presente un sistema più complesso di specchi e prismi per rendere il raggio monocromatico, oltre ad un dispositivo per sdoppiare il raggio. Nonostante le diversità tra i due strumenti, le parti essenziali che li compongono si possono così schematizzare:

                                          

1) Sorgente luminosa a filamento di tungsteno per il visibile e a vapori di deuterio per l’UV. La radiazione emessa è policromatica.

2) Sistema di fenditure, filtri e lenti per focalizzare, filtrare e indirizzare il fascio di luce in modo opportuno.

3) Monocromatore, ossia un apparecchio per isolare una certa banda di lunghezze d’onda quasi monocromatica. É costituito da un elemento disperdente (ad es. prisma) e da due sottili fenditure che servono come entrata ed uscita della radiazione; la fenditura d’entrata definisce uno stretto fascio luminoso che va a cadere sull’elemento disperdente. La fenditura d’uscita fa passare solo una stretta frazione di lunghezze d’onda.

4) Serie di specchi per indirizzare il raggio

5) Un eventuale sistema di specchi (chopper) che divide il raggio di luce in due raggi di uguale intensità (spettrofotometro a doppio raggio).

6) Alloggiamento per le celle (dette anche cuvette).

7) Rivelatore (elemento sensibile all’intensità della radiazione elettromagnetica) che trasforma il segnale ottico in segnale elettrico.

Il segnale viene analizzato o digitalizzato per ottenere il valore numerico dell’assorbanza A alle varie lunghezze d’onda. Allo strumento è collegato un registratore a carta per disegnare lo spettro (oppure, eventualmente, una stampante o un computer).

Nello spettrofotometro a raggio singolo vi è un solo alloggiamento per le celle: in questo caso per ogni lunghezza d’onda è necessario determinare l’assorbimento del solvente (il “bianco”) per sottrarlo dall’assorbimento del campione in soluzione.

Nello spettrofotometro a doppio raggio vi sono due alloggiamenti per le celle: uno per la cella contenente il solo solvente e l’altro per la cella contenente la soluzione campione. Un sistema elettronico esegue il confronto automatico ad ogni lunghezza d’onda dell’assorbimento delle due celle e sottrae il valore dell’assorbimento del solvente a quello della soluzione. Si ottiene così il valore d’assorbimento del solo soluto.

Le celle (generalmente di spessore 1 cm) che si utilizzano nel Visibile sono di vetro mentre quelle per l’UV sono di quarzo (poiché il vetro perde la sua trasparenza per lunghezze d’onda minori di 350 nm).

3.2 Procedimento

L’esperienza prevede la misura della concentrazione incognita di uno ione, previa verifica della legge di Lambert-Beer e costruzione di una curva di taratura.

Ovviamente deve essere nota la lunghezza d’onda λ del massimo assorbimento (in caso contrario occorrerebbe registrare lo spettro dello ione nell’intervallo di lunghezze d’onda del UV/Vis per stabilirla. Infine, se si vuole utilizzare il campo del Visibile deve essere noto l’eventuale reattivo colorante per la preparazione degli standard e del campione.

Costruzione della curva di taratura e verifica della legge di Lambert-Beer

Occorre preparare alcune soluzioni a concentrazione nota crescente dello ione da analizzare (soluzioni standard) con l’accortezza di prepararle in modo tale che la quantità del campione incognito rientri in tale intervallo. Allo scopo vi sono dei Kit analitici che approssimativamente ci danno, in tempi molto veloci, la concentrazione del campione da analizzare; oppure, se trattiamo con soluzioni colorate, è sufficiente che la tonalità di colore del campione da analizzare sia intermedia a quella delle soluzioni standard.

• Preparare su matraccio una soluzione madre dello ione da analizzare a concentrazione nota (Soluzione S1): di solito 100 o 200 mg/l.

• Prelevare dalla soluzione madre 5 aliquote di volume crescente (in genere da 1 a 40 ml) e trasferirle su matracci da 50 o 100 ml, ma non portarli ancora a volume. Ovviamente con semplici calcoli stechiometrici di diluizione deve essere nota la concentrazione dello ione che avremo sui singoli matracci: Soluzioni S1, S2, S3, S4, S5.

• Prima di portare a volume, introdurre - se necessario - l’eventuale reattivo colorante in tutte e cinque le soluzioni come da metodica avendo l’accortezza di ottimizzare i tempi di introduzione (ad esempio ogni 10-15 minuti da matraccio a matraccio) in modo da fare le letture spettroscopiche con comodo e lasciando lo stesso tempo di reazione nei vari matracci.

• Posizionare lo strumento alla λ corrispondente al massimo di assorbimento (per minimizzare gli errori su A dovuti agli errori su λ).

• Se si dispone di uno spettrofotometro a doppio raggio posizionare nell’apposito settore la cuvetta contenente il bianco. E procedere sempre alla correzione del fondo con l’apposito comando.

• Misurare l’assorbanza delle 5 soluzioni alla λ prescelta utilizzando la stessa cella, per mantenere rigorosamente costanti ε e d (vedi paragrafo 4). Ovviamente nel cambio la cella deve essere avvinata con la soluzione successiva ed è opportuno fare le letture a concentrazione crescente.

• Con i dati ottenuti si prepara una tabella del tipo sotto riportato

Determinazione della concentrazione incognita dello ione

Procedimento:

• si versano 50 ml dell’acqua da analizzare in un cilindro di vetro;

• si aggiunge, se necessario, il reattivo colorante;

• si lascia a riposo per circa per il tempo indicato dalla metodica;

• si esegue la lettura dell’assorbanza usando la stessa cella adoperata per costruire la curva di taratura;

• ricavare la concentrazione della soluzione per interpolazione grafica dalla curva di taratura.

4. Trattamento dei dati

Con i dati in tabella costruire il grafico dell’assorbanza in funzione della concentrazione dello ione di ogni soluzione (su carta millimetrata). Se il risultato è una retta passante per l’origine degli assi (vedi per esempio Figura 2) allora significa che assorbanza (A) e concentrazione (c) sono direttamente proporzionali e che la legge di Lambert – Beer:

A = εcd

è verificata (d è lo spessore della cella, ε il coefficiente di estinzione molare).

                                  

Verificare la linearità dei dati con il metodo dei minimi quadrati.

La pendenza della retta rappresenta il coefficiente di estinzione molare ε dello ione analizzato alla lunghezza d’onda considerata. Il coefficiente e corrisponde all’assorbanza di una soluzione a concentrazione 1M posta in una cella di spessore unitario.

Dal valore calcolato di ε (cm²/mmoli) determinare il valore della concentrazione della soluzione incognita (spessore cella d = 1cm) e confrontarlo con il valore ottenuto per interpolazione grafica.

Con l’uso dei fogli elettronici (ad es. Excel) la retta di taratura e i relativi calcoli sopra indicati sono eseguibili immediatamente dal programma.

Infine gli attuali spettrofotometri costruiscono da soli la retta di taratura e forniscono istantaneamente la concentrazione dello ione incognita.